Mueller Hinton Agar (MHA)

Dalam laboratorium mikrobiologi, presisi adalah kunci utama. Mueller Hinton Agar (MHA) merupakan media pertumbuhan bakteri yang direkomendasikan secara internasional oleh Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) dan European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) untuk uji sensitivitas antibakteri metode difusi cakram (Kirby-Bauer).

Pembuatan media MHA yang benar dan konsisten sangat krusial agar hasil pengukuran zona hambat antibiotik akurat dan dapat direproduksi (reproducible). Berikut adalah panduan langkah demi langkah cara preparasi MHA yang tepat.

Alat dan Bahan

Sebelum memulai, pastikan seluruh peralatan dalam keadaan bersih dan terkalibrasi.

Bahan:

• Serbuk Mueller Hinton Agar komersial
• Akuades (distilled water / deionized water)

Peralatan:

• Timbangan analitik
• Erlenmeyer / Botol Schott
• Gelas ukur
• Hot plate stirrer & magnetic stirrer
• Autoklaf
• Petri dish steril (diameter 90 mm)
• pH meter atau kertas pH indikator
• Water bath (opsional, untuk pendinginan)

Prosedur Pembuatan (Step-by-Step)

1. Penimbangan Serbuk

• Cek instruksi pada label wadah MHA komersial yang Anda gunakan (umumnya sekitar 38 gram per 1 Liter akuades, tetapi konsentrasi bisa sedikit bervariasi tergantung produsen seperti Oxoid, BD, atau Merck).
• Timbang serbuk MHA menggunakan timbangan analitik secara presisi sesuai volume media yang ingin dibuat.

2. Pelarutan Media

• Ukur volume akuades yang dibutuhkan menggunakan gelas ukur.
• Tuangkan sebagian akuades ke dalam Erlenmeyer, masukkan serbuk MHA, lalu tambahkan sisa akuades. Hal ini dilakukan untuk mencegah serbuk menggumpal di dasar wadah.
• Masukkan magnetic stirrer, letakkan di atas hot plate stirrer.
• Panaskan media sambil terus diaduk hingga larutan mendidih dan menjadi jernih sempurna (agar terlarut sepenuhnya).

Catatan: Jangan biarkan media mendidih berlebihan (overheating) karena dapat merusak nutrisi dalam agar.

3. Sterilisasi (Autoklaf)

• Tutup mulut Erlenmeyer dengan kapas/penutup aluminium foil.
• Sterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15 psi (1 atm) selama 15 menit.
• Setelah proses sterilisasi selesai, biarkan tekanan autoklaf turun hingga nol sebelum membuka pintu autoklaf.

4. Pengaturan pH dan Pendinginan

• Keluarkan MHA dari autoklaf dan biarkan mendingin di udara terbuka atau dalam water bath hingga mencapai suhu 45°C – 50°C (suhu di mana agar hangat saat dipegang namun belum memadat).
• Pemeriksaan pH: Setelah dingin (pada suhu ruang), pH akhir MHA harus berada di rentang 7,2 – 7,4. Jika pH terlalu asam atau basa, aktivitas beberapa jenis antibiotik (seperti aminglikosida atau macrolide) dapat terpengaruh.

5. Penuangan ke Cawan Petri (Pouring)

• Lakukan proses penuangan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF) atau di dekat api spiritus/Bunsen.
• Tuang MHA steril ke dalam Cawan Petri berdiameter 90 mm dengan kedalaman yang presisi.
• Ketebalan Kunci: Volume penuangan ideal adalah sekitar 25–30 mL per cawan, yang menghasilkan ketebalan agar tepat 4 mm.

💡 Mengapa ketebalan 4 mm penting?

• Jika agar terlalu tipis (< 4 mm): Antibiotik mendifusi terlalu cepat, menyebabkan zona hambat terlihat lebih besar dari seharusnya (false sensitive).
• Jika agar terlalu tebal (> 4 mm): Antibiotik mendifusi lambat/terhambat, menyebabkan zona hambat terlihat lebih kecil dari seharusnya (false resistant).

6. Pemadatan dan Pengeringan

• Goyangkan cawan secara perlahan dengan gerakan membentuk angka 8 agar permukaan MHA rata.
• Biarkan agar memadat pada suhu ruang.
• Jika terdapat embun air berlebih di tutup cawan, lakukan pengeringan (drying) sebentar di dalam incubator atau LAF yang menyala dengan posisi cawan sedikit terbuka selama 10 – 15 menit.

Penyimpanan dan Kontrol Kualitas

• Penyimpanan: Media yang sudah jadi dapat dibungkus dalam kantong plastik rapat dan disimpan dalam lemari es (suhu 2°C – 8°C). MHA umumnya stabil digunakan hingga 2 – 4 minggu selama tidak menunjukkan tanda-tanda dehidrasi atau kontaminasi.
• Kontrol Kualitas (QC):
  • Sterilitas: Inkubasi 1-2 cawan dari tiap batch pembuatan pada suhu 35°C selama 24 jam tanpa diinokulasi untuk memastikan tidak ada kontaminasi.
  • Performa: Uji batch baru menggunakan galur bakteri kontrol standar seperti Escherichia coli ATCC 25922 atau Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Kesimpulan

Preparasi Mueller Hinton Agar yang sesuai standar – khususnya pada aspek pH (7,2–7,4) dan ketebalan media (4 mm) – merupakan fondasi keberhasilan uji sensitivitas antibiotik di laboratorium. Ketelitian pada tiap tahap pembuatan akan menjamin validitas data diagnosis klinis maupun penelitian mikrobiologi Anda